Moloster :Contribution à l'identification des colorants par chromatographie sur papier

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Thèse de physique présentée à Faculté des sciences de l'Université de Paris
pour obtenir le grade de Docteur de l'Université

par



Zeev Moloster

Contribution à l'identification des colorants par chromatographie sur papier. Différentes applications



soutenue le 20 décembre 1957

devant la commission d'examen :
Prévost, C., président
Normant, Julia, M., examinateurs

 

LA CHROMATOGRAPHIE


Il semble que la chromatographie à ses débuts soit née de pratiques empiriques utilisées dans l'industrie de la teinture.


Les teinturiers contrôlaient l'intensité et la qualité d'un bain de teinture en mettant une goutte de liquide sur des matières absorbantes telles que du papier ou des tissus, et observaient les cercles concentriques correspondant aux différents constituants du colorant, qui se formaient autour de la goutte.


Le premier qui a étudié sérieusement ce phénomène a été F.F. Runge. Dans ses travaux publiés en 1850 et en 1855 il a constaté que la plupart des cations inorganiques pouvaient être séparés par leurs migrations différentes, quand leurs solutions étaient entraînées à travers du papier-filtre ou d'autres matériaux poreux.


F. F. Goppelsrœder nous parle d'analyse capillaire dans ses travaux en 1888. Il a examiné le comportement de mélanges de colorants sur des bandes de papier-filtre Suède, en trempant la partie inférieure du papier maintenu verticalement dans une solution aqueuse ou alcoolique des colorants. Le liquide s'élève par capillarité dans le buvard et la teinte jusqu'à une certaine hauteur. En travaillant avec un mélange d'acide picrique et de curcuma il a obtenu trois différentes zones : une zone aqueuse supérieure, une zone d'acide picrique au milieu et en bas la couleur jaune de curcuma. En immergeant la bande obtenue dans une solution diluée de KOH, la zone de l'acide picrique a complètement disparue et le curcuma a viré au rouge brun. Il a séparé ainsi l'acide picrique du curcuma.


Goppelsrœder a eu le mérite d'introduire la notion particulièrement intéressante qui nous est connue aujourd'hui sous le nom RF.


Un autre, parmi les premiers chercheurs dans le domaine de la chromatographie sur papier a été G.F. Schoenbein, qui s'est inspiré largement, comme d'ailleurs Goppelsrœder, des travaux de Runge.


En 1897, Day a établi que le pétrole brut pouvait être purifié par passage à travers de la chaux pulvérisée ou autres adsorbants et des impuretés pouvaient de ce fait être fractionnées.


Dans de nombreux pays, les chimistes du pétrole se sont rendus rapidement compte de l'importance des travaux de Day.


Engler et Albert, vers 1907, utilisent une colonne spéciale contenant du charbon de bois, leur permettant de recueillir séparément chaque fraction du filtrat et de l'étudier par la mesure de son point d'ébullition, de sa densité et de sa viscosité.


Mais le promoteur de la chromatographie est sans doute le botaniste M. Tswett, dont les premiers travaux furent publiés en 1903 et 1906. En faisant passer à travers une colonne de carbonate de calcium pulvérisé, le liquide d'épuisement de feuilles vertes (dans l'éther de pétrole) il observa une séparation qui se produisit au bout d'un très court trajet. Tandis que le solvant se décolore et continue à parcourir la colonne, l'ensemble des pigments est retenu près du haut de la colonne, sous forme d'un anneau. En ajoutant de l'éther de pétrole pur sur la colonne, l'anneau se décompose en une série de zones annulaires distinctes, de différentes teintes, et qui avancent avec des vitesses diverses. A cette méthode de fractionnement d'un mélange complexe en ses éléments, Tswett donna le nom de chromatographie.


C'est en 1931, que Kuhn et Lederer, grâce aux travaux de Tswett, ont réussi à séparer des carotènes et xanthophylles sur des colonnes d'alumine et de carbonate de calcium en coupant la colonne à la hauteur des différentes zones, après le développement.


En 1938, Steiger et Reichstein ont introduit le chromatogramme liquide, qui a permis le fractionnement de produits incolores ; il consiste à laver la colonne à l'aide d'une série de solvants d'un pouvoir éluant de plus en plus fort et de recueillir séparément chaque filtrat.


Entre 1940-1943, Tiselius a développé une méthode chromatographique connue sous le nom «d'analyse frontale» où le mélange à séparer est utilisé comme propre substance de déplacement. Les fractions des liquides sont recueillies en évitant soigneusement leur mélange, et sont ensuite étudiées par des méthodes optiques.


C'est aussi Tiselius et plus tard S. Claesson qui ont introduit la technique de l'analyse par développement. Elle consiste à séparer les composés à l'aide d'éluants qui sont beaucoup plus absorbés par l'adsorbant que les composés mêmes. Les éluants se fixent sur l'adsorbant en même temps qu'ils déplacent et libèrent les composés adsorbés antérieurement.


La chromatographie de partage a été introduite par Martin et Synge en 1941. Le principe de la méthode consiste à filtrer une solution des substances à séparer sur une colonne d'un support solide imbibé d'un autre solvant, non miscible avec le premier.


La chromatographie de partage sur papier a été mise au point en 1944 par Consden, Cordon et Martin.


Cette dernière méthode a trouvé de nombreuses applications et donné des résultats étonnants car elle permet avec une technique très simple, la séparation de très petites quantités de substances.


Limitée au début aux acides aminés elle fut plus tard, appliquée aux sucres, alcaloïdes anthocyanidines, antibiotiques, sapogénines, éléments minéraux, enzymes, stéroïdes, etc.


Le principe de cette méthode, très différent de celui de la chromatographie sur alumine ou autres adsorbants, est basé sur l'emploi des coefficients de partage et non sur une absorption sélective.


Déposons sur un papier-filtre de structure fine et homogène, une goutte de deux ou plusieurs substances en solution, puis après dessiccation, plongeons ce papier dans un mélange de solvants. Le liquide va imbiber progressivement le papier par capillarité et lorsqu'il rencontrera les substances déposées sur ce dernier, les entraînera avec lui. Mais cet entraînement est sélectif, de telle sorte que le déplacement de chaque substance étant différent, celles-ci seront séparées les unes des autres et pourront être aisément identifiées en pulvérisant sur le papier un réactif convenable, qui révèle la position atteinte par chacune d'elles. Pour les colorants, une telle révélation est inutile, sauf dans des cas spéciaux, que nous verrons plus tard.


La chromatographie sur papier peut se faire per ascensum (comme-décrit ci-dessus), elle peut être descendante, en faisant descendre le solvant et peut s'effectuer en deux dimensions.


Cette dernière façon d'opérer consiste à développer le papier avec un premier solvant, à le sécher, puis avec un deuxième solvant, à développer dans une direction perpendiculaire à la première.


En 1948, L. Ruter a décrit pour la première fois la chromatographie circulaire sur papier, dont les détails ont été publiés en 1950. Elle consiste à obtenir des bandes concentriques, sur un papier-filtre de forme circulaire placé entre deux plaques de verre dont l'une est< percée au centre d'un orifice pour l'arrivée du solvant de développement.


Si la chromatographie descendante permet la séparation des substances à faible RF (rapport des distances parcourues par la substance et par le solvant) la chromatographie ascendante est plus simple du point de vue de l'appareillage, et peut être mise en œuvre dans n'importe quel laboratoire, en donnant d'excellents résultats.


La plupart des travaux connus sur la chromatographie des colorants sur papier, ont été faits par la méthode ascendante ; c'est cette méthode que nous avons utilisée.


Parmi les importantes études de chromatographie sur papier des colorants on citera celles de N.R. Rao, K.H. Shah et K. V. Ventkataraman qui ont séparé différents colorants acides, basiques et directs. M. Lederer a chromatographie des indicateurs et des colorants dérivés de l'acridine, M. Zahn a analysé des colorants pour laine ; G. Seris a chromatographie des colorants alimentaires en employant la chromatographie sur papier et celle sur colonne. D.H. Tilden a publié en 1952 une liste de 27 solvants différents qu'il a employés pour l'identification des colorants alimentaires. Plus tard Tilden a comparé par la spectrophotométrie les courbes d'absorption des colorants isolés par chromatographie et celles des colorants connus et a trouvé qu'elles sont identiques.


G. Berile, M. Stein et E. Pascucci ont chromatographie 19 colorants alimentaires. En 1953, Y. Ishida, N. Inagaki, A. Shiota et R. Watanabe ont chromatographié et identifié différents colorants alimentaires solubles dans l'eau.


J.R.A. Anderson et E.C. Martin ont chromatographie 36 colorants alimentaires et essayé d'établir une relation entre la structure des colorants monoazoïques et la valeur du RF.


Paul Jax et H. Aust ont chromatographie des colorants employés pour la coloration du beurre et du fromage. H.Thaler et G. Sommer, suggèrent un solvant standard pour tous les groupes de colorants : 2 p. 100 de citrate de sodium dans une solution de 5 p. 100 d'ammoniaque. G. Panopoulos et J. Megaldoikomos ont examiné la coloration artificielle du caviar rouge par l'amarante. J. Mouselise et D. Miranda ont chromatographie des matières colorantes artificielles dans des confitures, en employant un papier préalablement traité avec CO3Ca.


Saenz Lascano Ruiz a publié en 1956 une étude sur l'extraction et l'identification des colorants incorporés aux aliments, en utilisant les chromatographies circulaire et ascendante.


Le même auteur a publié en 1946 et 1948, des travaux sur la séparation analytique de mélanges de colorants synthétiques alimentaires, en utilisant la chromatographie sur colonne avec différents adsorbants.


Nous-même, en 1952 avions adopté la méthode d'analyse chromatographique sur papier pour l'étude des traits d'encre de textes manuscrits.


Les gouttes de colorants obtenues à partir de traits d'encre d'origines différentes étaient chromatographiées simultanément ; la position des spots obtenus et la couleur respective des différentes taches permettaient une comparaison facile des encres.


Dans ces essais les spots présentaient souvent des traînées ; ils étaient allongés. La détermination du RF était douteuse. Ils nous permettaient cependant de différencier des encres d'origine et de composition différentes, même si nous n'étions pas capable d'identifier le colorant utilisé.


Pour que la chromatographie devienne une méthode d'analyse des matières colorantes, il fallait chercher dans quelles conditions expérimentales il était possible d'avoir pour chaque colorant un spot net, sans queue, dont le R, serait bien établi.


C'est ce problème que nous avons tenté de résoudre et qui fait l'objet de ce travail



CONCLUSION


Nous nous étions proposé d'utiliser la chromatographie sur papier comme méthode d'analyse des matières colorantes.


En 1952 nous avions utilisé avec succès la chromatographie sur papier pour la comparaison des encres à base de colorants organiques. Toute-fois nous n'avions pas toujours réussi à obtenir la séparation parfaite des différents colorants d'un mélange, parce que les spots obtenus avaient des queues. La détermination du RF des différents colorants restait le plus souvent douteuse.


Il fallait donc entreprendre une mise au point de cette méthode et pour cela trouver pour chaque famille, un solvant qui permettrait d obtenir une bonne séparation des colorants sur le chromatogramme sous forme de taches circulaires sans queues, dont le Rf serait facile à déterminer.


Ne pouvant étudier toutes les familles de colorants, nous donnons ci-dessous le nom de celles ayant retenu notre attention :

Colorants nitrosés.

Colorants nitrés.

Colorants azoïques.

Colorants pyrazoloniques.

Colorants du diphénylméthane.

Colorants du triphénylméthane.

Colorants dérivés de l'acridine.

Colorants dérivés de la quinoléine.

Colorants thiazoliques.

Colorants oxaziniques.

Colorants thiaziniques.

Colorants aziniques.


Ces familles comprennent la plupart des colorants hydrosolubles et liposolubles.


Après bien des essais infructueux, nous avons réussi à trouver, pour chaque famille de colorants, un solvant permettant d'obtenir, pour tous les colorants étudiés, des spots parfaitement nets.


Ces solvants sont des mélanges d'alcool ou d'éther-sels convenablement purifiés, dont les proportions relatives ont été soigneusement déterminées pour obtenir un maximum d'efficacité. Ils sont généralement acidifiés par de l'acide acétique ou de l'acide formique ou alcalinisés par de l'ammoniaque.


Avec ces solvants et dans les conditions bien établies (température, durée de la chromatographie, solvants convenablement purifiés et en utilisant le même papier), nous avons déterminé le RF des colorants chromatographiés.


Nous avons indiqué aussi la couleur de la tache obtenue telle quelle apparaît en lumière ordinaire et en lumière ultra-violette de Wood, puis ses variations après attaque par un alcali ou un acide dilué.


Que le colorant en solution soit seul ou mélangé avec d'autres de la même famille, le résultat fut toujours le même.


Nous avons donné très souvent des photographies de chromatogrammes en lumière ordinaire et en lumière de Wood.


Au cours de ces essais nous avons pu constater que le RF d'un colorant donné, restait invariant, que ce colorant soit fabriqué à des époques différentes par un seul fabricant ou qu'il le soit par des maisons différentes


Ce long travail nous a montré que dans une chromatographie de matières colorantes la présence d'un spot avec queue n'était jamais causée par une impureté des colorants mais était due à un mauvais choix du solvant.


Après avoir étudié les colorants des différents groupes isolés ou mélangés entre eux, nous les avons fait intervenir dans des mélanges complexes employés dans des produits d'utilisation courante tels que rouges à lèvres, encres stylographiques ou encres des stylos à bille. En utilisant une méthode d'extraction très simple, sans séparation spéciale des matières colorantes, nous avons réussi à les identifier par la méthode chromatographique précédemment mise au point.


Pour l'étude des colorants de rouges à lèvres et d'encres de stylos à bille, nous avons utilisé deux solvants qui peuvent être considérés comme universels pour tous les colorants liposolubles.


On pourrait les utiliser pour les colorants des cosmétiques et ceux des produits alimentaires gras.


Ce sont : solvant n° 1 :

H2O     60 cm3

Alc. éthylique     25

Acétate d'éthyle   12

Ammoniaque     3


Solvant n° 2 :

Le même que le n° I, mais où l'ammoniaque est remplacée par l'acide formique (3 cm3).


Pour l'identification ou la séparation d'un mélange de colorants liposolubles, l'utilisation successive de ces deux solvants n'est pas inutile ; dans le cas de chromatogrammes obtenus avec le solvant n° 2, il faut après séchage, le soumettre à l'action des vapeurs ammoniacales qui peuvent faire réapparaître certaines taches.


Il faut noter que l'identification d'un colorant sera d'autant plus sûre que l'on aura pu chromatographier simultanément le colorant de référence.


Dans la dernière partie de notre travail nous donnons plusieurs exemples d'analyse chromatographique de rouges à lèvres de marques différentes.


La méthode donne d'excellents résultats avec les traces de rouges à lèvres déposées sur des bouts de cigarettes.


L'étude des encres stylographiques a été faite avec des encres de marques connues, de couleurs bleue, noire, bleu noir, violette, verte et rouge.


La petite quantité de colorant nécessaire correspond à celle d'un trait d'encre pris sur un texte manuscrit.


Nous avons étudié les encres de plusieurs stylos à bille de marques différentes et nous avons constaté, dans une même teinte, le peu de diversité des colorants utilisés par les fabricants.


L'utilisation de plus en plus courante des stylos à bille rend donc de plus en plus difficile l'expertise des textes manuscrits.


Si nous résumons nos conclusions nous pourrons dire qu'à condition d'utiliser un solvant approprié, il est possible de résoudre par la méthode chromatographique un grand nombre de problèmes d'analyse de matières colorantes, même si celles-ci entrent dans la composition de substances complexes.





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