Thèse présentée à l’Institut national polytechnique de Lorraine
pour obtenir le grade de Docteur-Ingénieur en sciences agronomiques

par

Thierry Heulin

Etude de quelques azospirillum et de leurs effets spécifiques sur l'exsudation racinaire du riz

soutenue le 27 mai 1983

devant la commission d'examen :
Guckert, A., président
Bardin, R., Admont, P. H., Balandreau, J., et Warembourg, F., examinateurs

 

INTRODUCTION GENERALE

La démonstration de la fixation de l'azote atmosphérique par les Rhizobium, contenus dans les nodules de légumineuses, (HELLRIEGEL et WILLFARTH, 1886) fut à l'origine de très nombreuses découvertes ayant permis l'amélioration et l'application agronomique de ce processus. Le succès qu'a connu la recherche sur la fixation symbiotique de l'azote peut s'expliquer, en grande partie, par l'importante efficience de cette fixation d'azote par les Rhizobium (rendant possible sa mise en évidence par les bilans d'azote) et par la spécificité étroite des symbioses Rhizobium-légumineuses.

La fixation non symbiotique de l'azote associée aux graminées, en revanche, n'a pas bénéficié d'un tel essor. Pourtant, dès 1925, TRUFFAUT et BEZSSONOFF apportaient une première évidence de la fixation d'azote par les bactéries associées au maïs. La faible intensité de la fixation non symbiotique, excepté dans le cas des rizières, n'a pas permis sa détection par les méthodes de bilans azotés et c'est en 1969, qu'au Centre de Pédologie de Nancy, fut mise en évidence de façon certaine l'activité de bactéries fixatrices libres (non symbiotiques) dans la rhizosphère du maïs (HAUCKE-PACEWICZOWA et al. , 1969). Cette démonstration a été établie grâce à l'utilisation de la méthode à l'acétylène, mise au point à la suite de la découverte que l'acétylène était un substrat possible de la nitrogénase, au même titre que N2 (SCHÖLLHORN et BURRIS, 1967 ; DILWORTH, 1966). La comparaison de la fixation symbiotique et non symbiotique de l'azote sur la base de leurs efficiences et de leurs spécificités conduit aux remarques suivantes :

In situ, la fixation symbiotique par les légumineuses peut atteindre 500 kg/ha en 6 mois chez Crotalaria usaramoensis (HENZELL et NORRIS, 1962) et 370 kg/ha/an chez Desmodium intortum (WHITNEY et al., 1967), en passant par des moyennes de l'ordre de 150 à 200 kg/ha/an par les espèces cultivées tempérées telles que la luzerne et le trèfle. Cette fixation représente 25 à 85% des besoins en azote des légumineuses, suivant les espèces, durant un cycle de végétation (HARDY et HAVELKA , 1975). Ces pourcentages sont comparables à ceux que l’on peut obtenir avec certaines graminées (telles que le riz, BALANDREAU et al., 1974) puisque la fixation non symbiotique associée peut satisfaire entre le tiers et la moitié des besoins en azote de ces plantes.

La sélection chez les légumineuses d'un genre (Rhizobium) et même d'une espèce bactérienne (variant selon le type de légumineuses) pour la fixation d’azote est une situation originale par rapport à celle des graminées. Cette spécificité de l'association plante-bactéries n'a été décrite que dans quelques cas en ce qui concerne les graminées. Nous pouvons citer l’association d’Azotobacter paspali avec une seule variété de Paspalum notatum (Batatais) (DÖBEREINER, 1970 ; DÖBEREINER et DAY, 1975).

En ce qui concerne les Azospirillum, le premier indice d'une certaine spécificité a été fourni par BALDINI et DÖBEREINER (1980). Ces auteurs indiquent que les A. lipoferum sont spécifiques des plantes en C4 (maïs,.sorgho) et les A. brasilense spécifiques des plantes en C3 (blé riz orge).

De 1’aveu même de ces auteurs, il existe des exceptions à cette règle, comme par exemple la canne à sucre (plante en C4) dont les racines sont colonisées par A. brasilense. Parmi les souches d'Azospirillum isolées de la rhizosphère du riz cultivé en Camargue, l'une est un A. brasilense (A95), les 3 autres des A. lipoferum (4B, 4T et G1) (THOMAS-BAUZON et al., 1981 ; BALLY et al., 1983 ; PIDELLO, 1978). L'approche de la spécificité des Azospirillum vis-à-vis des plantes en C3 et C4 repose, dans l'article de BALDINI et DÖBEREINER (1980) sur la fréquence d'isolement des deux espèces d'Azospirillum dans différentes rhizosphères. Or, il semble que le critère "fréquence d'une espèce" bactérienne voire même abondance de cette espèce dans une rhizosphère, ne puisse pas être pris en compte pour définir la spécificité. En effet ROVIRA (1965) a montré que les Rhizobium sont fortement stimulés dans la rhizosphère des graminées sans que l'on puisse dire pour autant que les Rhizobium soient spécifiques des graminées

D'autre part, et contrairement aux Rhizobium qui ne peuvent fixer 1’azote qu’en présence de leur plante-hôte, les bactéries fixatrices libres sont capables de réduire l'azote dans la rhizosphère de graminées très différentes.

Par exemple, dans notre laboratoire, nous avons montré que des Azospirillum isolés de Digitaria (A. brasilense Sp7) et du maïs (A. lipoferum B7C) possédaient des activités nitrogénasiques en présence de riz, équivalentes à celles d'une souche isolée du riz (A. lipoferum 4B

Convaincue du fait que la spécificité entre les diazotrophes et les graminées ne se situait pas au niveau de l'abondance rhizosphérique de ces bactéries, ni à celui de leur activité nitrogénasique, notre équipe a envisagé l’étude de cette spécificité en d'autres termes. Des travaux antérieurs nous ont permis d’entrevoir l'existence d'une telle spécificité au niveau de mécanisme intervenant probablement dans la colonisation des racines. Dans notre laboratoire, MANDIMBA (1982) a pu montrer que les bactéries qu'il avait isolé du maïs (Enterobacter cloacae, Azospirillum lipoferum) étaient très nettement attirées parle mucilage de maïs récolté stérilement. Par contre, les souches isolées du riz, appartenant aux mêmes espèces, n'étaient pas du tout attirées par ce composé. Ces résultats plaident en faveur d'une spécificité dans le chimiotactisme de diazotrophes vis-à-vis d'un composé exsudé par une graminée (mucilage du maïs), située à un niveau inférieur à l'espèce et pouvant être comparé au chimiotactisme différentiel des Rhizobium vis-à-vis des exsudats racinaires des légumineuses (CURRIER et STROBEL, 1977).

Les résultats obtenus plus récemment par GUENIN-TABARY (1983) corroborent les précédentes. En effet son étude de l’attachement spécifique de certaines bactéries fixatrices d’azote à la lectine de riz marquée au 14C, montre que, contrairement aux bactéries isolées de la de la rhizosphère du maïs (Beijerinckia sp., Azospirillum lipoferum), les bactéries isolées du riz, la même espèce, sont spécifiquement attachées à la lectine du riz. La spécificité de ce processus en ce qui concerne le partenaire bactérien se situe à un niveau inférieur à l'espèce, comme dans le cas précédent.

Il semble donc que deux des étapes probables de la colonisation, le chimiotactisme et l'attachement aux lectines, soient spécifiques en ce qui concerne le partenaire bactérien.

D'où l'idée de rechercher s'il existe une spécificité au niveau ; d'un autre processus pouvant avoir un rôle dans la colonisation : la stimulation de l'exsudation racinaire par des diazotrophes. Pour étudier ce problème, nous avons voulu nous placer dans les meilleurs conditions :

- Matériel bactérien représentatif. Nous avons, pour cela, utilisé des souches isolées par le modèle spermosphère (THOMAS-BAUZON et al., 1982) et présentes dans le sol à des densités initiales supérieures à 10⁵ par g de sol sec.

- Matériel génétique stable et bien défini. Les souches bactériennes sont pures, identifiées (détermination des Azospirillum dans le chapitre I) et homogènes (étude des conséquences de la variation de phase chez Azospirillum, chapitre II). Les semences de riz sont des G1, génétiquement très homogènes.

- Situation expérimentale simple ; modèle spermosphère permettant l'établissement d'un bilan du carbone (chapitre III), le but de ce travail étant d'étudier un processus complexe (stimulation de l'exsudation) à l'aide d'un modèle expérimental simple et reproductible.

Au cours de ce travail, nous avons pu mettre en évidence l’influence de certains paramètres microbiologiques sur l’exsudation racinaire du riz. Ces paramètres étaient d’ordre écologique (différentes rhizosphères de graminées ayant servi à l’isolement des bactéries : riz, maïs), taxonomiques (A. lipoferum/A. brasilense) et physiologique (mobile/immobile, en condition ou non de fixation de N2).

Cette étude de l’exsudation racinaire a pu être réalisée grâce à la mise au point d’un modèle expérimental gnotobiotique simplifié (modèle spermosphère) permettant d’évaluer avec précision l’exsudation d’une semence de riz en germination par rapport au carbone total mobilisé au cours de cette germination (bilan du carbone). La très bonne reproductibilité de ce modèle a rendu possible la comparaison de l’effet de l’inoculation de différente bactéries sur l’exsudation racinaire.

Nous avons pu noter, à partir des quelques bactéries étudiées, une spécificité de la stimulation de l’exsudation racinaire du riz, liée à la nature de la plante ayant servi à l’isolement. En effet, trois des quatre souches isolées de la rhizosphère du riz sont capables d’augmenter significativement l’exsudation de celui-ci, en modèle spermosphère (A. lipoferum 4B : 20 à 21% ; A. lipoferum 4T : + 33% ; A. brasilense A95 : + 34%), alors que la souche A. lipoferum B7C isolée du maïs n’a aucun effet sur cette exsudation. Ces résultats semblent montrer qu’il pourrait y avoir une spécificité, se situant à un niveau inférieur à l’espèce, de la stimulation de l’exsudation racinaire par les bactéries fixatrices d’azote. Deux autres études effectuées dans notre laboratoire ont permis de montrer l’existence d’une telle spécificité en ce qui concerne le chimiotactisme et l’attachement aux lectines.

L’étude du chimiotactisme de quelques diazotrophes a permis à MANDIMBA (1982) de mettre en évidence d’importantes différences d’attraction de ces bactéries vis-à-vis du mucilage de maïs, recueilli stérilement. En effet, les bactéries isolées de la rhizosphère du maïs (A. lipoferum B7C et Enterobacter cloacae L33) sont nettement attirées par les mucilage de maïs (méthode dérivée de celle d’ADLER, 1973) alors que des bactéries isolées du riz, identiques taxonomiquement, ne sont quasiment pars attirées (A. lipoferum 4B, Enterobacter cloacae 7Atr) tout comme le témoin non rhizosphérique E. coli K12 P678.

Plus récemment GUENIN-TABARY (1983) a montré que, contrairement aux souches isolées de la rhizosphère du maïs (Beijerinckia Sp 39J, A. lipoferum 37C), celles de la rhizosphère du riz (Beijerinckia Sp 8M, A. lipoferum 4B et 4T) fixaient spécifiquement la lectine du riz marquée au 14C.

Le premier chapitre de ce travail portait sur la taxonomie des Azospirillum et nous a permis de déterminer l'espèce de quelques souches isolées de la rhizosphère du riz (4B, 4T, A95) et du maïs (B7C), d'après les critères biochimiques proposés par TARRAND et al. (1978). La situation taxonomique des Azospirillum utilisés (A. lipoferum, A. brasilense) n'a pas d'influence sur l'exsudation racinaire puisque A. lipoferum 4B et 4T (+21% et +33%) stimulent autant cette exsudation que A. brasilense A95 (isolé du riz). Ce résultat est en contradiction avec l'hypothèse de BALDINI et DÖBEREINER (1980) puisque tout d'abord les Azospirillum isolés du riz appartiennent à la fois à l'espèce A. lipoferum (4B et 4T) et à l'espèce A. brasilense (R07 et A95), alors que d'après ces auteurs, les A. brasilense sont nettement plus fréquents dans la rhizosphère d'une plante en C3 telle que le riz. Ensuite, même en utilisant un mécanisme (la stimulation de l'exsudation) permettant de mettre en évidence une éventuelle spécificité, la comparaison de souches appartenant aux deux espèces d'Azospirillum ne fait pas apparaître une telle spécificité. Cette étude demande également à être complétée par des comparaisons interspécifiques à l'intérieur d'autres genres bactériens tels que Enterobacter et Beijerinckia. De plus, pour démontrer que la spécificité n'est liée ni à l'espèce ni au genre bactérien, il faudrait, comme cela a été fait pour le chimiotactisme et l'attachement aux lectines, comparer entre eux quelques genres de bactéries fixatrices d'azote (Flavobacterium, Beijerinckia. Enterobacter et Klebsiella) vis-à-vis de la stimulation de l'exsudation.

Si l'on admet que la stimulation de l'exsudation ainsi que le chimiotactisme et l'attachement aux lectines sont des processus intervenant dans la colonisation des racines, ce qui est vraisemblable, la sélection de certaines bactéries, au sein de la microflore, au moment de l'apparition des racines dans un sol, ne sera pas fonction de leur appartenance à une espèce ou à un genre particulier mais plutôt de leur capacité à être attirées, fixées à la surface des racines et à stimuler l'exsudation racinaire. Le cadre de ces expériences pourra être élargi à des bactéries provenant d'autres rhizosphères mais également à l'utilisation d'autres graminées que le riz. Cette augmentation du nombre de combinaisons entre plantes et bactéries permettra de confirmer ou de donner des limites à nos résultats au sujet de la spécificité au niveau de la stimulation de l'exsudation et de la reconnaissance par les lectines.

La mise en évidence d'une variation de phase liée à la mobilité chez A. lipoferum 4B (et également chez A. lipoferum B7C et Br 10) est la première description d'une telle variation chez cette bactérie. Elle a été suivie d'une part d'une étude de la fréquence des variations mobile/immobile et immobile/mobile et d'autre part d'une recherche des conséquences physiologiques d'une telle variation.

A partir d'un clone bactérien (4B Rif nommée 4B 40N1) nous avons montré que la variation mobile/immobile se produisait avec une fréquence de l'ordre de 0.85.10^-3 par bactérie et par génération. De plus, à partir d'une des colonies contenant des individus immobiles (4BpHT2) nous avons obtenu une réversion de cette variation dont la fréquence est d'environ 1,85.10^-3 par bactérie et par génération. Les individus mobiles obtenus à partir de cette réversion ne semblent pas, de par leur mobilité plus limitée, équivalents à la souche mobile d'origine (4B 40N1). Les caractéristiques de cette variation de phase (existence d'une réversion et fréquences) affectant la mobilité chez Azospirillum sont comparables à celles décrites chez Salmonella typhimurium (ZIEG et al., 1977), E. coli K12 CSH50 (EISENSTEIN, 1981) et Proteus mirabilis (SILVERBLATT, 1974).

La comparaison des souches mobiles et immobiles nous a permis de constater que ces dernières (4BpHT2 et 4T) possèdent des activités spécifiques de la nitrogénase supérieure à celles de la souche mobile 4B, aussi bien en présence d'acide malique et sous 1% d'oxygène (p02 optimale pour l'activité nitrogénase des trois souches) qu'en modèle spermosphère constitué d'un milieu faiblement gélose (3%o). Ces trois souches ont également été étudiées en modèle spermosphère pour leur action sur l'exsudation. De nouveau, les souches immobiles présentent des activités spécifiques de stimulation de l'exsudation nettement supérieures (4BpHT2 : + 40% et 4T : 33% ) à celles de la souche mobile 4B (+ 20%) .

Au niveau de la colonisation, il apparaît que la souche mobile possède un avantage par rapport aux souches immobiles dans la mesure où elle va pouvoir "se rendre" à proximité des racines et utiliser plus rapidement les exsudats, par contre elle semble beaucoup moins efficiente en terme d'activité spécifique de la nitrogénase et de stimulation de l'exsudation.

Les perspectives offertes par cette mise en évidence d'une variation de phase chez Azospirillum sont de deux types :

Etude de la dynamique des populations de ces deux souches à proximité et à la surface des racines.

Ces résultats ouvrent d'autres perspectives au niveau de l'inoculation des graminées par des bactéries fixatrices d'azote. L'utilisation de telles bactéries, capables d'augmenter le carbone exsudé par la plante de façon spécifique, est-elle un bénéfice pour ces plantes, dû au surcroît de l'azote fixé par les bactéries associées ? Si tel est le cas, ce mécanisme, au même titre que le chimiotactisme et l'attachement aux lectines deviendrait un critère de sélection pour les souches à inoculer.

L'influence de quelques paramètres microbiologiques sur l'exsudation racinaire du riz a été étudiée au cours de ce travail.

Une meilleure définition du matériel bactérien de départ a nécessité :

- La détermination de l'espèce de certaines souches d'Azospirillum.
Il apparaît que cette détermination est assez délicate dans certains cas. Afin de confirmer l'appartenance d'une souche immobile (4T) au genre Azospirillum il a été nécessaire de faire appel à des techniques d'hybridation ADN/ARN (BALLY et al., 1983).

L’étude de la production de mutants immobiles par la souche A. lipoferum 4B ; ces mutants apparaissent spontanément à très haute fréquence (0,85.10^-3 par bactérie et par génération). Cette variation de phase a été mise en évidence chez trois souches d'A. lipoferum (4B, B7C, Br 10) et n'a pu être décelée chez les A. brasilense Sp7,R07,A95 et 51e. A partir d'une souche immobile (4BpHT2) provenant de la souche 4B, des révertants mobiles ont été obtenus (fréquence : 1,85.10^-3 par bactérie et par génération). Les principales caractéristiques physiologiques de ces souches immobiles (4BpHT2 et 4T) sont l'utilisation du glucose à très faible concentration en 02 (1%) contrairement aux bactéries mobiles (optimum pO2 > 8%) et une activité spécifique de la nitrogénase supérieure à celle de la souche mobile (4B).

L'étude de l'influence de ces, paramètres microbiologiques sur l’exsudation a été rendue possible par la mise au point d’un modèle expérimental simple : le modèle spermosphère permettant l’établissement d’un bilan du carbone et l’évaluation précise et reproductible de cette exsudation. Il a pu être monté, grâce à cette méthode, que les souches d’A. lipoferum et A. brasilense isolées de la rhizosphère du riz stimulaient l’exsudation de 21 à 34% par rapport à un témoin stérile. Cette stimulation est indépendante, de la fixation de l’azote par ces bactéries, dans nos conditions expérimentales. En outre, la bactérie immobile 4BpHT2 stimule deux fois plus cette exsudation que la bactérie mobile dont elle est issue pour une croissance bactérienne équivalente.

Enfin, la stimulation de l'exsudation par les Azospirillum isolés du riz (4B, 4T, A95) n’est pas observée pour un A. lipoferum isolé de la rhizosphère du maïs ; ceci semble indiquer une certaine spécificité de ce mécanisme, comme cela a déjà été mis en évidence pour le chimiotactisme (MANDIMBA, 1982) et l'attachement aux lectines (GUENIN-TABARY, 1983).